Автор: Нонна Кирилловна Родосская, профессор, д.м.н.
ИСТОРИЯ НЕЗАКОНЧЕННОГО НАУЧНОГО ПОИСКА
UNFINISHED SCIENTIFIC RESERCH HISTORY
Не надо бояться тяжёлой задачи,
а надо бояться дешёвой удачи.
Е. Евтушенко
Доктор медицинских наук, профессор Нонна Родосская
DМ, professor Nonna Rodosskaia
Воронеж (Российская Федерация) Клиника «Медицинская практика»
Voronezh (Russian Federation). Clinic «Medical Practice»
Tel . +7 (910)-242-51-66; Е-mail: doctor.rnk@gmail.com
АННОТАЦИЯ. В этой статье рассказывается, о том, как было открыто неизвестное ранее физиологическое явление, относящееся к области иммунологии; о том, как у исследователя в процессе работы расширяются границы познания и, как, казалось бы, частный случай оказался проявлением системной реакции организма на стресс. Эта статья также о важности таких качеств ученого как настойчивость и целеустремленность.
ABSTRACT. This article describes how a physiological phenomenon related to immunology was discovered. We will see the expansion of our knowledge during the research process. A special case turned out to be a manifestation of the organism adaptation reaction. This article is also about the importance of scientist qualities such as persistence and aspiration for aim.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Инактивация IgM антител; Сульфгидрильные группы; Цистеин; Вторичный иммунодефицит
KEYWORDS: IgM antibodies inactivation; Sulfhydryl groups; Cysteine; Secondary immunodeficiency
В 1957 году в Ленинграде была крупная эпидемия полиомиелита. Болели не только дети, но и взрослые. Из числа заболевших около 10% больных погибали, а еще 40% становились инвалидами. В то время научным сотрудником лаборатории медицинской микробиологии научно-исследовательского института антибиотиков работала Нина Васильевна Журавлева (1927–2014 г.г.). Микробиология была предметом профессиональных интересов Нины Васильевны. Во время эпидемии полиомиелита заболел ее младший сын. И уже тогда ей стала не давать покоя мысль о нарушениях иммунитета. Отчего они происходят, отчего даже новая вакцина Чумакова – Смородинцева – Сэбина не всегда всесильна? Так судьба забросила молодого ученого в иммунологию. Нину Васильевну заинтересовали такие защитники живого организма как антитела.
Образование антител – сложный процесс, в результате которого образуются молекулы белков — иммуноглобулины. Они и являются антителами, которые способны бороться с антигеном. Основные классы антител – это иммуноглобулины (Ig) M, G, А, E, D. Нина Васильевна начала изучать работу антител уже в Воронеже, куда переехала в шестьдесят втором году. Здесь Нина Васильевна становится руководителем отдела иммунологии Центральной научно-исследовательской лаборатории Воронежского мединститута. Этим отделом она руководила до 1994 года. В своей научной работе на звание доктора медицины «Некоторые иммунологические эффекты кровопусканий» она описала явление, ранее неизвестное иммунологам — явление подавления активности IgM антител.
С каким же феноменом столкнулась Нина Васильевна при проведении экспериментов на кроликах в 1964 году? Кровопускания в небольших дозах на начальных этапах стимулируют иммунную систему. Это известный факт. У кроликов в данном случае стимулировалась выработка естественных (или, так называемых, нормальных) антиинфекционных противодизентерийных антител IgM. (Естественные антитела определяются в организме без предшествующей иммунизации или болезни). Однако, при продолжении цикла кровопусканий количество IgM антител резко снижалось в сыворотке крови. При этом, в лимфатических узлах IgM антитела продолжали интенсивно вырабатываться. В сыворотке крови появлялись частицы антител с более низкой молекулярной массой и низкой активностью по отношению к антигену. Почему и откуда появились эти частички антител? Возникло много вопросов, на которые надо было найти ответы.
Последовали годы экспериментов, раздумий и решений этих вопросов.
Нина Васильевна рассказывала о том, что мысли о решении этой научной проблемы занимали ее постоянно (Особенно хорошие идеи приходили во время занятий домашней работой). Н.В. Журавлевой было высказано предположение, что в крови животных появляется неизвестный ранее фактор, подавляющий активность сывороточных антител именно класса IgM, снижающий сопротивляемость к заражению животных инфекционным возбудителем. Эффект подавления активности IgM антител диагностировали по способности сыворотки крови животного или человека снижать агглютинирующую способность IgM антител тест-системы in vitro ( т.е. «в пробирке»).
Анализ литературы направил научный поиск в сторону исследования содержания активных сульфгидрильных (SH-) групп крови и аминокислоты цистеина. Почему именно цистеина и ее SH-групп и почему было важно иммунологу и микробиологу погрузиться в основы биохимии? Сульфгидрильная, или тиоловая, группа – это одновалентная группа, состоящая из атома серы и водорода. Она легко окисляется и входит в состав цистеина. Цистеин является одной из 20 аминокислот, из которых состоят белки. Отличие цистеина от других аминокислот и его уникальность состоит в том, что он содержит тиоловую (-SH) группу. За счет сульфгидрильной группы цистеин участвует в окислительно- восстановительных реакциях. При этом, эти реакции окисления-восстановления являются обратимыми. Именно цистеин широко использовался в иммунологии для разделения антител с высокой и низкой молекулярной массой.
Здесь опять мы должны немного отвлечься и посмотреть на антитела.
Антитела класса M (IgM) организованы наиболее сложно. Молекула IgM представляет собой пентамер — полимер из пяти мономеров (субъединиц), подобных молекуле IgG. IgM часто называли макромолекулярными антителами из-за их высокой молекулярной массы. Пять мономеров связаны между собой дисульфидными (-S-S-) мостиками (рис. 1).
Рисунок 1. Пентамерная структура IgM антитела.
Вот здесь и кроется ответ на вопрос, откуда в сыворотке появились «частицы» антител, соответствующие по молекулярной массе IgG, в то время как в лимфоидных органах синтезировались IgM антитела. В организме экспериментальных животных (in vivo) происходил тот же процесс, что и в пробирке (in vitro) при разделении антител. Под воздействием ингибирующего фактора происходит восстановление дисульфидных связей IgM с образованием субъединиц. И они являются гораздо менее активными при взаимодействии с антигеном. На самом деле, появление подавляющих (ингибирующих) свойств сыворотки крови по отношению к IgM антителам сопровождается повышением содержания в крови цистеина и свободных (т.е. несвязанных с белком) SH-групп.
Далее Нина Васильевна воспроизвела феномен подавления активности IgM антител в опыте, в котором их выработку в организме животных (кроликов) стимулировали ежедневным введением малых доз убитой брюшнотифозной вакцины (в течение месяца). Такая схема иммунизации, во-первых, ведет к выработке именно IgM антител. А во-вторых, напоминает естественное поступление инфекционного антигена в организм из очага хронического инфекционно-воспалительного процесса. И в этом варианте эксперимента появление ингибирующих свойств сыворотки крови совпадало с повышением в крови сульфгидрильных групп и цистеина.
Что же все-таки представляет собой соединение, которое названо естественным фактором, ингибирующим активность IgM антител? Где же, кроме сыворотки крови находится ингибирующий фактор? Дальнейшее исследование феномена показало, что свойством подавлять активность IgM антител обладает не только сыворотка крови, но и сывороточный альбумин, а также экстракты печени подопытных животных. Так вышел на свет новый участник этой научной истории. Альбумин – это белок, который находится в сыворотке крови. Альбумин вырабатывается в печени. Он имеет уникальные физико-химические свойства. Дисульфидные группы (S-S) и свободная SH-группа в составе молекулы обеспечивают ему гибкость структуры. Это позволяет ему связывать и транспортировать метаболиты (в том числе и низкомолекулярные, как, например, цистеин). И он — один из немногих белков, в которых происходит реакция тиол-дисульфидного обмена.
Обобщая полученные на этом этапе экспериментальные данные, Нина Васильевна высказала предположение о том, что ингибирующий фактор сыворотки крови представляет собой с одной стороны аминокислоту цистеин, а с другой — смешанное соединение (дисульфид), состоящее из белка (альбумина) и низкомолекулярной аминокислоты цистеина с активной SH-группой. Можно сказать, что на этом этапе исследования стала оформляться концепция, говорящая о том, что ингибирующий фактор является результатом определенного (в физиологических рамках) нарушения окислительно-восстановительного равновесия в организме. В чем же заключается физиологический смысл появления этого ингибирующего фактора? Исследователю нужно было сформировать гипотезу, для определения дальнейшей цели и задачи исследования.
Нина Васильевна сформулировала значение феномена подавления активности антител как физиологическую реакцию организма, направленную на контроль (снижение) уровня крупных молекул IgM антител в крови: появляющиеся в определенных условиях ингибирующие свойства сыворотки крови участвуют в поддержании гомеостаза (постоянства внутренней среды организма).
В 1977 г. Явление ингибирования активности антител было зарегистрировано как научное открытие.
В дальнейших исследованиях по этой проблеме мне посчастливилось принять непосредственное участие. Логика научного поиска поставила перед нами следующие вопросы:
1.Как влияет длительное присутствие ингибирующего фактора в крови на показатели образования антител?
2. Можно ли воспроизвести ингибирующую активность сыворотки крови у экспериментальных животных и человека?
3. Какие факторы могут инактивировать ингибирующую активность сыворотки крови? Решение их имеет не только теоретическое, но и практическое значение (как в области инфекционной патологии, так и при аутоиммунных состояниях).
Ответ на первый вопрос: в экспериментальных условиях было установлено, что ингибирующий фактор определяется в сыворотки крови животных в течение 10-14 дней. (Этому предшествует возрастание гормона стресса гидрокортизона). Этот период сопровождается снижением количества уже циркулирующих IgM антител. Дальнейшее сохранение ингибирующих свойств сыворотки крови ведет к снижению образования антител — снижается число антителообразующих клеток в лимфоидных органах (лимфатические лимфоузлы, селезенка). Таким образом, развивается вторичное иммунодефицитное состояние (это состояние, характеризующееся снижением активности или неспособностью организма к эффективному осуществлению реакций иммунитета). Оно напрямую связано с интенсивностью ингибирующих свойств сыворотки крови. При этом, при исчезновении ингибирующих свойств сыворотки крови активность IgM антител и интенсивность антителообразования восстанавливаются. Таким образом, данный вид иммунодефицита является обратимым.
Ответ на второй вопрос. Из литературы известно, что гормон стресса гидрокортизон стимулирует выработку цистеина в печени. Экспериментально мы установили связь повышения гормона гидрокортизона в сыворотке крови с появлением в ней ингибирующей активности и повышением сульфгидрильных (SH-) групп. Многочисленные эксперименты на животных (кроликах, крысах, мышах) показали, что ингибирующая активность сыворотки крови и последующее снижение интенсивности антителообразования могут быть воспроизведены введением животным цистеина, а также – гидрокортизона. В связи с тем, что явление снижения интенсивности образования антител в организме млекопитающих под действием естественного ингибирующего фактора ранее было неизвестно в иммунологии, этот феномен был зарегистрирован как открытие (2001 г.).
Ответ на третий вопрос. Да, в организме существуют механизмы восстановления нарушенного гомеостаза. Экспериментально это подтверждается следующим: ингибирующие свойства сыворотки крови могут быть инактивированы введением экспериментальным животным гомологичного (т.е. полученного от этого же вида животных) альбумина.
Другой способ инактивации ингибирующих свойств сыворотки крови основан на ранее выявленной нами способности SH-групп окисляться под воздействием атмосферного кислорода в опытах in vitro. В условиях in vivo этот эффект воспроизведен воздействием кислорода под повышенным давлением (гипербарическая оксигенация) как на подопытных животных, так и на пациентах. В обоих случаях вторичный иммунодефицит не развивался. В экспериментах, когда ингибирующую активность сыворотки крови воспроизводили введением животным цистеина, иммунодефицитное состояние не возникало в том случае, если животному вводили гомологичный альбумин или проводили сеансы гипербарической оксигенации.
За годы исследований и обобщения результатов было выявлено значение ингибирующего фактора для прогнозирования течения болезни у пациентов с различными заболеваниями. Можно резюмировать: продолжительное (более 14 дней) присутствие ингибирующей активности сыворотки является неблагоприятным фактором в случае инфекционно-воспалительных процессов в организме больного. В этом случае мы ожидаем хроническое, длительное течение воспаления, развитие осложнений. Напротив, при аутоиммунном заболевании наличие ингибирующих свойств сыворотки крови является благоприятным признаком.
У онкологических больных присутствие ингибирующей активности сыворотки крови снижало эффективность лечения (пациенты с острым лейкозом). Эти больные были в большей степени подвержены сопутствующим инфекционным осложнениям. Продолжительность жизни у больных с ингибирующим фактором оказалась значительно меньше. Мы вначале не предполагали, что у этих больных активность ингибирующего фактора будет напрямую связана со снижение содержания альбумина в сыворотке крови. Но это оказалось именно так.
Далее … А далее осталось много нерешенных вопросов. Исследования по этой теме, к сожалению, не продолжаются. Поэтому пришлось сесть за стол, подумать, проанализировать и обобщить полученные результаты. Они позволяют рассматривать появление ингибирующих свойств сыворотки крови как системную реакцию организма на стрессорный фактор (стрессорный фактор, или иначе стрессор, способен вызвать в организме общую реакцию напряжения. Такими факторами в наших исследованиях являлись кровопускания, введение животным вакцины, инфекционно-воспалительные и аутоиммунные заболевание у пациентов).
Если длительность стрессорной реакции в виде появления ингибирующих свойств сыворотки крови небольшая (10-14 дней), то появившийся ингибитор активности IgM антител является механизмом адаптации, контролируя уровень IgM антител и интенсивность иммунного ответа. При этом, как нам представляется, идет активация гипоталамо-гипофизарно–надпочечниковой оси с последующим увеличением синтеза кортизола, участием цистеина и сывороточного альбумина (участие печени). Длительное функционирование ингибитора активности IgM антител ведет к развитию вторичного иммунодефицитного состояния. Представьте себе, что пациента с ингибирующей активностью сыворотки крови иммунизируют, (т.е. вводят убитую вакцину, чтобы защитить его от возможного заражения в будущем). На фоне вторичного иммунодефицита, вызванного ингибирующим фактором, вакцинация будет неэффективна. Или представьте, что пациенту с ингибирующей активностью сыворотки крови для лечения, имеющегося у него заболевания, вводят уже готовые IgM антитела. Ожидаемого защитного эффекта мы не увидим.
Далее можно порассуждать, почему у некоторых больных ингибирующий фактор определяется продолжительное время. Можно предположить, что у ряда пациентов с ингибирующей активностью сыворотки крови альбумин не может полноценно инактивировать ее. Возможно, стрессор постоянно стимулирует синтез повышенного уровня кортизола. Ряд пациентов имеет другую реакцию на стресс: даже кратковременное функционирование ингибитора у них не определяется. А это может вести к повышенной предрасположенности к аутоиммунным болезням. Таким образом, индивидуальный подход к оценке данных исследования, позволит прогнозировать течение заболевания и определить тактику лечения.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Rodosskaia N.K., Chernousova G.M. Immune system and thiols: Some peculiarities of thiol exchange. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 2010; 33(1):65-71. https://doi.org/10.1016/j.cimid.2008.08.001
2. Rodosskaia N. Thiol Containing Redox System from the Viewpoint of_Pathophysiology a Review. https://www.researchgate.net/publication/271126019 DOI: 10.5455/jppa.20130720012707
От редакции: Иммунология
Иммунология — медико-биологическая наука, изучающая реакции организма на чужеродные структуры (антигены): механизмы этих реакций, их проявления, течение и исход в норме и патологии…
Иммунология — Википедия
ru.wikipedia.org›Иммунология
Иллюстрация: 5biologiya.net
